主营产品:

日本三菱厌氧产气袋,厌氧培养罐,厌氧产气包,厌氧培养盒,ZETA LIFE 胎牛血清,转染试剂,无血清培养基,生物技术服务代做
服务热线:

15021202164

当前位置:上海创凌生物科技有限公司 > 产品中心 > 分子生物学试剂 > 提取试剂盒 > Fast One Step Cloning Kit REF AZ00008

联系我们/CONTACT US

联系人:李小姐

电 话:15021202164

手 机:15021202164

地 址:上海市杨浦区国定东路275号8号楼815

邮 编:200433

传 真:

邮 箱:2640904730@qq.com

阿仪网商铺:http://www.app17.com/c130448/

手机网站:m.shlc-bio.com

产品简介

Fast One Step Cloning Kit REF AZ00008

Fast One Step Cloning Kit REF AZ00008

价格:电议

采购度:194    原产地:中国大陆

发布时间:2023/11/8 14:51:18

Fast One Step Cloning Kit REF AZ00008
美国Azaood公司成立于2004年,是一家开发和生产用于生命科学研究、诊断和生物技术应用的高质量纯化酶、蛋白质、核酸和细胞分离试剂盒、胎牛血清的行业导者;Azood公司是通过了ISO9001认证的主要制造商,可以满足从研究到大规模批量生物加工和OEM应用与要求的公司。

分享到:
详细信息
 储运条件

-20℃

产品组成

产品简介

基于重组原理的无缝克隆技术,作为新一代的克隆方法,不依赖繁琐的酶切、连接步骤,也不需要末端补平等操作,依据DNA 片段与线性化载体末端的15~25 nt 同源序列的重组,可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点,载体自连背景低,是一种简单、快速、高效的DNA 定向克隆技术。

Fast One Step Cloning Kit 无缝克隆试剂盒,一次反应可完成单至多个DNA 片段的重组,快仅需5 分钟即可完成单片段重组,且阳性率高于95%。Kit 中添加的辅助因子,有效提高克隆阳性率;经优化的反应体系,能够一定程度上耐受未纯化PCR 产物中含有的杂质。升版的无缝克隆试剂盒具有更高的阳性率、更好的兼容性。

实验步骤

1. 实验流程概要

2. 线性化克隆载体制备

选择合适的克隆位点,对载体进行线性化,载体的线性化可以通过酶切或反向PCR 扩增完成。

① 酶切制备

一些限制性内切酶不能有效地消化超螺旋DNA,因此可能会留下不同数量的未切割载体DNA,降低阳性率。推荐使用LightNingTM 快速内切酶进行酶切(单酶切或者双酶切),使载体线性化完全,以降低转化背景(未切割的载体转化获得的假阳性克隆)。

注1:经酶切进行线性化的载体无需去磷酸化,推荐使用双酶切。

注2:酶切完成后,建议将内切酶失活或对目的产物纯化后用于重组反应。

② 反向PCR 扩增制备

为减少扩增突变的引入,推荐使用高保真PCR Mix 进行扩增。推荐使用预线性化质粒作为模板,以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。

注1:PCR 产物无非特异性条带时, 推荐使用Template Eliminator( 货号:EG21203)消化质粒模板即可用于重组反应;反之建议将PCR 产物纯化后使用。

注2:多片段克隆时,建议将PCR 产物纯化后使用。

3. 插入片段PCR 引物设计

PCR 引物的5' 端必须包含与其相邻片段(插入片段或载体)末端同源的15~25 nt(推荐18 nt)序列。假如载体为粘性末端,且3' 端突出,则引物设计必须包含突出部分;若5' 端突出,则引物设计可以包含突出部分,也可以不包含。

插入片段正向扩增引物:

5'—上游载体末端同源序列+ 酶切位点(可选)+ 基因特异性正向扩增序列— 3'

插入片段反向扩增引物:

3'—基因特异性反向扩增序列+ 酶切位点(可选)+ 下游载体末端同源序列—5'

注1:尽量选择无重复序列且 GC 含量均匀的区域进行克隆,当载体克隆位点上下游25 nt 区域内 GC 含量为40%~60% 时,重组效率高;

注2:本试剂盒所提供的pUC 19 载体(Ampr)连接端序列如下:

4. 插入片段的PCR 扩增

推荐使用高保真PCR Mix 进行扩增,以减少扩增突变的引入。建议使用纯化后的PCR 产物进行无缝克隆反应,若PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定为特异性扩增产物,可直接使用,但加样体积不应超过总反应体积的20%。

5. 重组反应

① 于冰水浴中配置以下反应体系:

a. 适载体用量(ng) = 0.02 × 载体碱基对数,即0.03 pmol。

b. 插入单片段,适片段用量(ng)= 0.04 × 片段碱基对数;插入多片段,每片段适用量(ng)= 0.02 × 片段碱基对数。

注1:若插入单片段的长度大于载体,则应互换载体与插入片段用量;

注2:若插入片段的长度小于200 bp,则插入片段应使用5 倍载体用量;

注3:若按上述公式计算得到的用量超过低/ 高值,则建议直接按低/ 高用量使用;

注4:载体片段过长、插入片段过长或片段数过多,克隆阳性率均会降低。

重组反应体系配制完成后,用移液枪轻轻吸打混匀各组分,避免产生气泡,切勿涡旋。

② 将反应体系置于50℃,反应5~60 min。

注1:推荐使用 PCR 仪等温控比较精准的仪器进行反应,反应时间不足或太长克隆效率均会降低;

注2:插入1~2 个片段时,推荐反应时间为5~15 min;插入3~5 个片段时,推荐反应时间为15~30 min;

注3:当载体骨架在10 kb 以上或插入片段在4 kb 以上时,建议延长反应时间到30~60 min;

注4:50℃反应完成后,建议进行瞬时离心,将反应液收集至管底。

③ 将反应液离心管置于冰上冷却,之后进行转化或者储存于 -20℃。

注 1: -20℃储存的重组产物,建议在 1 周内使用。

6. 重组产物转化

取5~10 μl 反应液,加入到100 μl 感受态细胞中,缓慢吸打混匀,冰上放置30 min。42℃ 热激45~60 sec,冰浴5 min。加500 μl SOC或 LB 培养基,37℃ 振荡培养40~60 min(200 rpm)。将菌液均匀涂布在含有对应抗生素的平板上,倒置于37℃ 过夜培养。

注1:不同感受态细胞后的克隆阳性率会有所差别,推荐使用转化效率 > 108 CFU/μg的感受态细胞;

注2:菌落数取决于PCR 产物与线性化载体的数量和纯度;

注3:阳性对照平板通常生长大量白色单菌落,阴性对照平板只生长很少的菌落。

7. 阳性克隆检测

挑取单菌落至10 μl ddH2O 中混匀,95℃裂解10 min 后,取1 μl裂解液作为模板,进行菌落PCR 鉴定,或将单菌落接种至抗性培养基中培养过夜后,提取质粒进行酶切鉴定。

阳性对照的阳性克隆检测,菌落PCR 引物使用通用引物M13F 与M13R,酶切鉴定用HindIII 与EcoRI。

注1:菌落PCR 时建议至少使用一条通用引物,避免假阳性结果;

注2:必要时可进一步对阳性结果进行测序鉴定。

注3:M13F:TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R:CAGGAAACAGCTATGAC

更新时间:2024/1/4 13:19:58

在线留言

在线咨询,尊敬的客户您好,我们会尽快回复您的咨询!

您感兴趣的产品* 您还没有输入您感兴趣的产品
您的单位* 您还没有输入您的单位
联系人* 您还没有输入联系人
联系电话* 您还没有输入联系电话
详细地址
常用邮箱 您输入的邮箱格式不正确
请输入您对我们的意见或建议* 您还没有输入您对我们的意见或建议
验证码* 您还没有输入验证码

发送留言重置

温馨提示

1.遵守中华人民共和国有关法律、法规,尊重网上道德,承担一切因您的行为而直接或间接引起的法律责任。

2.请您真实的反映产品的情况,不要捏造、诬蔑、造谣。如对产品有任何疑问,也可以留言咨询。

3.未经本站同意,任何人不得利用本留言簿发布个人或团体的具有广告性质的信息或类似言论。

相关文章

首 页| 公司介绍| 产品展示| 公司新闻| 技术文章| 联系我们| 客户留言

阿仪网 设计制作,未经允许翻录必究. 联系人:李小姐 联系电话:15021202164 ICP备案号:沪ICP备17045613号-1 总访问量:845023 管理登录

主营产品:日本三菱厌氧产气袋,厌氧培养罐,厌氧产气包,厌氧培养盒,ZETA LIFE 胎牛血清,转染试剂,无血清培养基,生物技术服务代做

扫一扫,关注我们!

联系方式

15021202164
18049739651

工作时间

(8:30-17:30)